28 Mayıs 2011 Cumartesi

Veriticillium Solgunluğu

Ege Ünv. Zir. Fak. Bitki Koruma Bl.
Fitopataloji Anabilim Dalı
Veriticillium Solgunluğu
Türkiye'de zeytin yetiştiriciliğinde mevcut zararlı ve hastalık sorunlarına ek olarak Verticillium solgunluğu olarak bilinen ve ağaçlarda kısmi dal kurumalarına veya tam kurumaya neden olan bir hastalık daha kendini göstermeye başlamış-tır. Verticillium dahliae isimli bir fungusun neden olduğu bu hastalık aslında ülkemiz zeytinliklerinde 70' li yıllardan beri bilinmektedir ancak son on yıl içerisinde özellikle taban arazilerde kurulmuş, sulama olanağına sahip, genç zeytinlik tesislerinde, üreticileri çok kaygılandıracak bir yaygınlığa ulaşmıştır. Bu nedenle Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Adnan Menderes ve Ege Üniversiteleri Ziraat Fakülteleri ve TARİŞ AR-GE Müdürlüğü bu konuya araştırma ve çiftçi eğitimi düzeyinde eğilme gereği duymuşlardır.
Verticillium solgunluğunun zeytin ağaçlarında oluşturduğu iki farklı belirti vardır. Bunlardan ilki, kış sonundan ilk baharın ilk aylarına kadar gelişen ve kendini daha çok sürgün ve dalların kuruyarak ölmesi olarak belli eden akut solgunluktur. Belirtiler önce yaprakların renginin açılması, sonra kahverengiye dönerek uzunlamasına geriye doğrı kıvrılması ile başlar. Eğer uçlardan geriye doğru kuruma ve ölüm çok hızlı gelişir ise bu durumda 'inme' adı verilen ve ağacı tümden ölüme götüren ağır bir tablo ortaya çıkar. Diğer belirti ise ilkbaharda akut solgunluk belirtilerinden sonra ortaya çıkan ve yaz aylarına doğru yavaşça gelişen kronik solgunluk belirtileridir. Ancak bu defa kuruma ilk olarak çiçeklerde meydana gelir. Çiçekler ölür ancak sürgünlerin üzerinde asılı kalırlar. Daha sonra bunu hastalıklı dallar üzerinde bulunan yaprakların renginin donuk yeşile dönerek dökülmesi izler. Dallar çıplaklaşır, sadece sürgün uçlarındaki yapraklar kalır. Hastalıklı sürgün ve dalların kabuğu kırmızımsı kahverengi olur ve içteki iletim dokularıının rengi de koyulaşır. Kronik solgunluğun akut solgunluktan bir diğer farkı da bundan etkilenen zeytin ağaçlarının yıllar içerisinde, hastalık şiddetinin yavaş yavaş azalmasına neden olacak biçimde bir iyileşme sergilemeleridir.
Zeytin ağaçlarında solgunluğa neden olan bu fungus mikrosklerot adı verilen dayanıklı yapılar oluşturur. Bunlar sayesinde toprakta, her hangi bir konukçu bitki olmasa da çok uzun yıllar hatta onbeş sene kadar canlılığını sürdürebilir.
Mikrosklerotların büyük bir kısmı toprak yüzeyinde ya da toprağın üst katmanlarında bulunurlar. Bu nedenle sulama ve yağışların neden olduğu yüzeysel su akışı ile kuvvetli rüzgarlar hastalık etmenini çevreye dağıtabilir. Ayrıca hastalıklı bitkilerden dökülen yapraklar da rüzgarla uçuşarak komşu tarlaları bulaştırabilirler. Bütün bu yayılma yollarının dışında hayvan gübresi, karıkla ve salma sulama ile tarım makinalarının neden olacağı bulaşmayı da gözardı etmemek gerekir. Fidanlıklarda etmenle bulaşık filiz, sürgün ve anaçların, yeni zeytinliklerin tesisi sırasında ise hastalıklı fidanların kullanılması hastalığı temiz ve uzak bölgelere bulaştırır.
Zeytin Verticillium solgunluğu en yaygın ve şiddetli olarak kendini 0-10 yaşlı genç tesislerde göstermektedir. Etmen 50 yaşından daha yaşlı ağaçları çok ender olarak yakalar. Ayrıca, daha önceden pamuk, domates, patlıcan gibi V. dahliae' ye duyarlı bitkilerin yetiştirildiği topraklarda tesis edilen zeytinliklerde hem daha sık hem de yüksek şiddette solgunluk oluşmaktadır.
Yazının başında da belirtildiği gibi hastalık ülkemizde 'yeni' değildir. İlk kez 1972 yılında kayıtlara geçtiğine göre en azından 40 yıla yaklaşan bir süredir zeytinliklerimizde bulunduğunu tahmin edebiliriz. Ancak, özellikle son yıllarda Ege bölgesinde yeni zeytinlik tesislerin kurulmasının hız kazanmasına paralel olarak daha çok dikkat çekmeye başlamıştır. Türkiye' de bu hastalığın Batı Anadolu' daki yaygınlık durumu, zeytinliklerin yakalanma oranı ve şiddetini belirlemek üzere Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü ile TARİŞ AR-GE tarafından iki yıl süren bir survey çalışması yapılmıştır. Ayrıca bu araştırmaya, hastalık ile tesis özellikleri ve yetiştirme tekniği arasındaki ilişkiyi belirlemek amacıyla bir üretici anketi de eklenmiştir.
Batı Anadolu illeri Aydın, Balıkesir, Çanakkale, İzmir, Manisa ve Muğla' da yer alan ve 'taban' karakterindeki alanlarda tesis edilmiş zeytinliklerde 1998 2000 yılları arasında yürütülen bu araştırmada, survey alanında hastalığın yaygınlık oranı yaklaşık % 55 olarak saptanmıştır ki bu da bize ziyaret edilen zeytinliklerin yarısında hastalın mevcut olduğunu göstermektedir. Solgunluk görülen zeytinliklerde ağaçların hastalığa yakalanma oranının ise ortalama % 0,9 olduğu belirlenmiştir. Bu oran hastalığın bulunduğu zeytinliklerde neredeyse her 100 ağaçtan birinin solgunluğa yakalandığını işaret eder ki, çok yıllık bir kültür bitkisi için bu hiç de önemsiz bir oran değildir. Ancak sevindirici olan bir husus, hasta ağaçlarda hastalık şiddetinin çok yüksek olmadığının, genelde tek dal kurumaları düzeyinde bulunduğunun gözlemlenmiş olmasıdır.
Yürütülen anket çalışmasından elde edilen ilk önemli sonuç tesis biçimi ile hastalığın yaygınlığı arasında kurulan ilişki olmuştur. Anket sonuçlarına göre bölgede yeni zeytinliklerin artık fidan kullanılarak tesis edilmeye başlandığı açıkça anlaşılmış ve hastalık da en yaygın olarak (% 75) bu tarz zeytinliklerde saptanmıştır. Ancak yine de bu bulgudan yola çıkarak hastalığın yalnızca fidanlıklardan alınmış bulaşık fidanlarla yayıldığını iddia etmek çok doğru değildir. Çünkü sökülmüş delicelerle tesis edilmiş zeytinliklerde de ortalama yaygınlık oranından ( %55 ) daha yüksek bir oranda (% 69) hastalığa rastlanmıştır. Ancak yine de ülkemiz zeytin fidanlıklarında Verticillium dahliae' nin varlığını saptamaya yönelik araştırmalar yürütmek gerekli görülmektedir.
Zeytinlerde Verticillium solgunluğunun sulanan bahçelerde daha yaygın olarak görüldüğüne dair yerleşmiş bir kanı mevcuttur. Bu nedenle anket çalışması sırasında bahçesinde hastalık mevcut olsun veya olmasın bütün üreticilere sulama yapıp yapmadıkları sorulmuştur. Yanıtlara göre sulama ile hastalık çıkışı arasında doğrudan bir ilişki kurmak kolay olmamıştır. Çünkü hastalık görülen zeytinliklerin % 41' inde, görülmeyenlerin ise % 20' sinde sulama uygulandığı anlaşılmıştır. Yani oran daha düşük olmakla birlikte Batı Anadolu' da hastalık görülmeyen bahçelerin bir kısmında da sulama yapılmaktadır.
Ankette yer alan bir soru da, hastalık görülen ve görülmeyen zeytinliklerde, tesisten önce varolan doğal bitki veya kültür bitkisinin niteliği ile ilgiliydi. Survey alanında hastalık saptanan 61 zeytinliğin %52' sinin yerinde daha önce fundalık, çalılık, ormanlık ve çayır gibi doğal vejetasyonlar ile susuz tarım arazilerinin bulunduğu görülmüştür. Buradan da anlaşılacağı üzere geçmişinde, etmenle doğrudan ilişkilendiremeyeceğimiz bir ön  
zeytinliklerde de bu hastalık görülebilmektedir. Ancak daha önce pamuk, asma, incir ve sebze gibi Verticillium dahliae' nin konukçusu olan bitkilerin yetiştirildiği 24 zeytinliğin 20 tanesinde bu hastalığın mevcut olduğu saptanmıştır. Yani öncesinde, etmene duyarlı olmayan bitkilerin bulunduğu zeytinliklerde de hastalık görülebilmekle birlikte Verticillium solgunluğu, daha önce duyarlı kültür bitkilerinin yetiştirildiği arazilere kurulan bahçelerde çok daha yaygın olarak problem oluşturmaktadır.
Bütün bu bilgilerin ışığı altında, zeytinde Verticillium solgunluğuyla mücadele etmenin hiç de kolay olmadığı anlaşılacaktır. Bunun en iyi yolu tesisten önce ve sonra önemli oranda kültürel önlemleredayanan entegre bir strateji izlemektir.
Zeytinlik tesisi öncesinde karşımıza çıkan en önemli iki unsur sağlıklı üretim materyali ve etmenle bulaşık olmayan topraktır. Uzun yıllar boyunca hastalığa duyarlı bir konukçu örneğin pamuk yetiştirilen etmenle bulaşık bir arazide hiç beklemeden zeytinlik kurmak, yaratacağı sonuçlar açısından hiçbir sürpriz taşımaz. Böyle bir zeytinlikte er geç Verticillium solgunluğu görüleceği çok açıktır. Ancak daha önce de değinildiği gibi etmenin toprakta bulunan mikrosklerotlarının çok uzun yıllar boyunca canlılıklarını sürdürebildikleri unutulmamalıdır. Ancak bulaşık bir araziyi bölgesel olarak toprak solarizasyonu ve chloropicrin ile fümigasyon yoluyla nispeten temizlemek mümkündür. Fakat chloropicrin henüz ülkemizde ruhsatlı değildir.
Zeytinlik tesisinden sonra da uygulanabilecek bazı yöntemler vardır. Örneğin zeytin ağaçlarındaki doğal iyileşme ağaçlara tek tek uygulanacak toprak solarizasyonu ile teşvik edilebilir. Yunanistan ve İspanya' da bu yöntemle olumlu sonuçlar elde edilmiştir. Ülkemizde halen Manisa ilinin Akhisar ilçesinde ağır solgunluk belirtileri gösteren bir zeytinlikte ilk defa bir solarizasyon denemesi yürütülmektedir.
Bu hastalığa dayanıklı çeşit veya anaçların belirlenmesi hastalıkla mücadele açısından kuşkusuz çok büyük bir önem. taşımaktadır. Ancak ülkemizde bu konu henüz araştırma aşamasındadır.
Zeytinlikte uygulanan sulama ve toprak işleme hastalık çıkışında çok önemli bir etkiye sahiptir. Derin ve ağaca çok yaklaşan bir sürüm köklere zarar vereceği için etmenin ağaca girişini kolaylaştırır. Sulanmayan zeytinliklerde de Verticillium solgunluğunun çıkması mümkündür. Ancak salma ve karıkla sulamanın bahçe içinde etmeni taşıma ve bulaştırmadaki rolü araştırmalarda kesinlikle ortaya konmuştur. Bu nedenle en azından hastalık görülen bahçelerde ve tabi ki yeni tesislerde damlama sulama teşvik edilmelidir.
Türkiye' de halen Zeytinde Verticillium solgunluğuna karşı ruhsatlandırılmış bir ilaç mevcut değildir. Zaten dünyada bu hastalıkla ile kimyasal mücadele amacıyla şimdiye kadar yürütülen çalışmalar mevcut fungisidlerden hiç birinin hastalığın kontrolünde yeterli olmadığını göstermiştir.
Ankette yönelttiğimiz bazı sorularla üreticilerin hastalık hakkındaki kanaatlarini ve bu sorunla nasıl başa çıkmaya çalıştıklarını da öğrenmeye çalışmıştık. Bahçesinde Verticillium solgunluğu görülen üreticilerin % 75' i bu hastalığın kaynağı hakkında hiçbir fikir yürütememekteydi. Üstelik bu hastalığın fungal bir nedene bağlı olabileceğini düşünen üretici sayısı ise sadece iki kişiydi. Ancak dikkat çekici diğer bir nokta ise üreticilerin % 80' ninin bu belirtileri en fazla 3 yıldan bu yana gözlemlemeye başladıklarını belirtmeleriydi. Buradan hastalığın bölgede henüz çok yakın bir geçmişe sahip olduğu ortaya çıkmaktadır. Yine de hastalığı tanıtmak ve mücadelesinde etkili olabilecek yöntemleri öğretebilmek için Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı yayın teşkilatınca hem üreticilere hem teknik personele yönelik bilgilendirme toplantıları yapılması kanımızca çok faydalı olacaktır.
Sonuç olarak uzun yıllardır varlığı bilinse de, Verticillium solgunluğu Batı Anadolu zeytinliklerinde son yıllarda bu ağaca duygusal olarak da çok bağlı olan bölge üreticilerini üzen ve kaygılandıran bir yaygınlık sergilemeye başlamıştır. Zeytincilik sektöründeki gelişmeler sonucunda, belli bir sermaye yatırarak daha modern zeytinlik tesisleri kuran ya da mevcut ağaçlarına daha özenli bir bakım uygulamaya başlayan bölge üreticilerinin karamsarlığa düşmesine engel olunabilmesi için bu hastalığın biraz daha önemsenmesi ve özellikle de tarım teşkilatına bağlı araştırma kuruluşları ve ziraat fakültelerince hastalığın mücadelesine yönelik araştırmalar yapılması çok gereklidir.

DİKKAT !...... ZEYTİNLERDE VERTİCİLLİUM HASTALIĞI

ZEYTİNLERDE VERTİCİLLİUM HASTALIĞI


Verticillium solgunluğu geniş konukçu dizinini dünyanın birçok yerinde etkilemektedir. Verticillium, ölmekte olan konukçu dokularında üreyen mikrosklerot halinde toprakta yaşamını sürdürür. Bu durum toprak nemine ve sıcaklığına bağlı olarak değişir. Toprağa bir kez bulaştığı zaman 10 yıl veya daha fazla süre toprakta canlı olarak kalabilmektedir, mikrosklerot formu bu sürenin uzunluğunda çok önemli rol oynamaktadır.

6 Mayıs 2011 Cuma

Mikrobiyolojik Ekim, Sayım ve Boyama Yöntemleri

MİKROORGANİZMA EKİM YÖNTEMLERİ ve SAYIMI:
 Tanım: Gıda maddesi üzerinde bulunan mikroorganizmaların sayılarının belirlenmesi amacıyla yapılan ekim işlemidir.
Gıda Bilimi ve Endüstrisi ile İlişkisi: Bir gıda maddesinde mikroorganizma sayısı belirlenerek o gıdanın gıda tüzüğünde belirtilen değerlere uygunluğunun saptanarak, sağlıklı olup olmadığı belirlenir.

Gıda Örneklerinde Toplam Bakteri Sayımı:
Özet:
Bu yöntem fermente gıdalar gibi doğal niteliği yönünden yüksek sayıda mikroorganizma  içerenler dışında bir çok gıdada kalite kriteri olarak kullanılır. Yöntemlerde belirtilen besi ortamlarına ekilen gıda örneği seyreltimleri belli süre ve sıcaklıkda, aerobik koşullarda inkübe edilir. Toplam bakteri sayımında, dökme ve yayma plak teknikleri gibi kültürel sayım yöntemleri kullanılır.

1. Dökme Plak Yöntemiyle Toplam Bakteri Sayımı:
Materyal:
·        Mikroskop
·        Otoklav
·        Etüv(220°C’ye kadar ayarlanabilir)
·        Su banyoları
·        Stomacher veya blender
·        Bunzen beki
·        Steril pens
·        Tüp karıştırıcı
·        Steril drigaski , özeler
·        Cam veya plastik steril petriler
·        Steril pipetler
·        Deney tüpleri ve tüp taşıyıcıları
·        Erlen, beher
·        Plate Count Agar(PCA),EMB
·        Mercimek

Metot:
Ø      10g gıda maddesi tartılır ve 90ml fizyolojik su içine konur. Bu karışım stomacher’de homojenize edilir. Bu dilisyon  –1 dilisyonudur.
Ø      –1 dilisyonundan  1ml alınır ve içinde 9 mlt fizyolojik su bulunan deney tüpüne aktarılır. Bu –2 dilisyonudur.
Ø      –2  dilisyonundan 1 ml alınarak içinde 9 ml fizyolojik su bulunan deney tüpüne aktarılır. Bu –3 dilisyonudur.
Ø      Üzerlerine seyreltim değerleri yazılmış petri kutularına –1,-2,-3 dilisyonlarından 1’er ml konulur. Petriler üzerindeki numaralar seyreltim numaraları  ile aynı olmalıdır.
Ø      Agarlı besi ortamı kaynar su banyosunda 45°C’ye kadar soğutulur. Her petriye 15-20 ml besi yeri dökülür.
Ø      Petrilere hafif salınım hareketi verilerek örnek ile besi yerinim karışması sağlanır.
Ø      Besi ortamı katılaştıktan sonra  petriler ters çevrilerek 25°C’ de 24-48 saat inkübe edilir.

Kullanılan Çözeltiler:
Plate Count Agar (PCA):
Trypton                     5 gr
Yeast agar                 2,5 gr
Glukose                    1 gr
Agar                          15 gr
Destile su                 1 lt


Eosin Methylen Blue Agar (EMB):
Pepton                   10 gr
Laktoz                    10 gr
K2HPO4                 2 gr
Agar                       15 gr
Eosın Y                   0,4 gr
Methylen Blue        0,065gr
Destile su              1 lt

2. Yayma Plak Yöntemiyle Toplam Bakteri Sayımı:
Materyal:
Gerekli cihaz ve malzemeler  dökme plak yönteminde anlatıldığı gibidir. Yalnız burada besi yeri olarak DRBC agar kullanılır. Bu besi yeri ile küfler sayılır.

  Metot:
Ø      –1,-2,-3 dilisyonları daha önce anlatıldığı gibi hazırlanır.
Ø      Boş petrilere 15-20 mlt besi yeri dökülür. Besi yerinin donması beklenir ve üzerine her dilisyondan  0,1 er  mlt  pipetle aktarılır.
Ø      Petrilere 0,1 er mlt örnek koyulduğu için bir kez daha seyreltim yapılmış gibi sayılır ve petrilere koyulan seyreltim derecesinden bir düşük sayı ile numaralandırılır:-1® -2
Ø      Koyduğumuz örnekleri drigaski ile agarın yüzeyine yayarız.
Ø      25°C de 5-7 gün inkübe edilir.

Kullanılan Çözeltiler:
DRBC Agar:
Glukoz                               10 gr
Bakteriyolojik pepton         5 gr
KH2PO4                              1 gr
MgSO4.7H2O                     0,5 gr
Rose bengal                       0,5 mlt
Dikloran                            1 mlt
Kloram fenikol                  0,1 gr
Agar                                  15 gr
Damıtık su                        1000 mlt

3. Direkt Ekim Yöntemi:
Materyal:
·        Malt Extract Agar(MEA)
·        Nohut
·        Diğer materyaller daha önceki yöntemlerde kullanılan materyallerdir.

Metod:
Ø      Behere 50 gram nohut konur. Üzerini kaplayacak kadar %4’lük NaOCl ile 1 dakika boyunca çalkalanır.
Ø      Daha sonra bu çözelti dökülüp nohutlar beher içinde steril su çalkalanır.
Ø      Steril su dökülüp tekrar steril su eklenir, çalkalanır ve dökülür.
Ø      Beş adet nohut steril bir pensle alınıp dikkatli bir şekilde besi yerine konulur. Nohutların petri kutusu içinde kaymamasına, birbirlerine değmemesine ve besi yerinin nohutlar dikilirken yırtılmamasına özen gösterilmelidir.

Kullanılan Maddeler:
Malt Extract Agar:
Malt Extract                   30g
Agar                               20g
Destile su                       1 lt

Mikroorganizma sayısının belirlenmesi:
Petri kutusunda sayım yaparken bakteriler ve mayalar için 25-250 koloni gelişmiş petriler seçilirken, küfler için ise 10-25 koloni gelişen petriler seçilir. Mikroorganizma sayısı aşağıdaki formül ile bulunabilir:
Mos. sayısı (cfu/g) = Petrideki koloni sayısı * petri kutusuna ekilen miktar (ml) /seyreltme oranı

Hata Kaynakları:
·        Dökülen besi yerlerinin petri kutusuna iyi dağıtılamaması.
·        Katı parçacıklar bulunan besi yeri dökülmesi.
·        Yeterli seyreltme yapılamaması.
·        Sayım yaparken dikkat edilmemesi.
 
 
 
BOYAMA YÖNTEMLERİ ve MİKROORGANİZMALARIN BOYANMASI:
Tanım:
Mikroorganizmaların pek çoğu renksiz olduklarından normal ışık mikroskobu ile görülmeleri zordur. Mikroorganizmaların mikroskopta görünür hale getirilmesi için preparat hazırlandıktan sonra uygun boya çözeltileriyle boyanmaları işlemine “mikroorganizmaların boyanması”denir.
Boya bir benzen halkasına bağlı kromofor ve okzokrom gruplarını taşıyan organik bir bileşiktir. Kromofor grup moleküle renk özelliği verir, ancak bu bileşik renkli olmasına rağmen henüz boya karakterinde değildir. Bu maddenin herhangi bir ortama tutunma özelliği yoktur. Bu özellik okzokrom grubu ile sağlanır. Okzokrom grubu moleküle elektrolitik çözünme özelliği vererek tuz meydana getirilmesini sağlar. Okzokrom grubu boyanın renk tonunu değiştirebilir. Ancak rengin ortaya çıkmasını sağlayamaz.

Boya Çeşitleri:
·      Bazik Boyalar: Bazik fuksin, Kristal violet, Metilen mavisi, Safranin.
·      Asit Boyalar   : Nigrosin, Eosin, Asit fuksin.
·      Nötr Boyalar  : Giemsa, Leishman

Gıda Bilimi ve Endüstrisi ile İlişkisi:
Boyama yöntemleri ile mikroorganizmaların sınıflandırılması ve tanımlanması, genel olarak şeklinin gözlenmesi mümkündür. Boyama ile bir gıda ürününün ekim işleminden sonra açığa çıkan kültürlerden şüphe duyulanların hangi mikroorganizmalar olduğu belirlenir. Böylece insan sağlığı açısından güvenilir bilgiler elde edilebilir. Ayrıca boya maddeleri mikroorganizmaların boyanmasının dışında başka amaçlar için de  kullanılmaktadır. Örneğin trifenil içeren bazı boyalar bazı mikroorganizmalar üzerine öldürücü etkiye sahip olduklarından, mikroorganizmaların izolasyonunda besi yerine inhibitör ajan olarak ilave edilmektedir. Böylece istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini önleyerek besi yerine seçici özellik kazandırır.

Boyama Yöntemleri:
·      Basit Boyama
·      Gram Boyama
·      Endospor Boyama
·      Flagella Boyama
·      Kapsül Boyama
·      Küf Boyama
 
1.      Gram  Boyama

Tanım:
Mikrobiyolojide çok kullanılan bir yöntemdir. Bakteriler bu yöntemle iki gruba ayrılırlar. Mor-menekşe renge boyanmış mikroorganizmalar gram pozitif, pembeye boyananlar ise gram negatif olarak tanımlanırlar. Bazı mikroorganizmaların yaşlandıkça gram reaksiyonlarında değişiklik olabileceğinden 18-24 satlik genç kültürlerden hazırlanan preparatlar kullanılmalıdır.
 
Materyal:
·        Lam
·        Öze
·        Besiyerinde bakteri kültürü (PCA petrisinde)
·        Boya çözeltileri: Crystal violet, gramın iyot çözeltisi, safranin veya sulu fuchsin
·        %95’lik etil alkol
·        Kurutma kağıdı
·        İmmersiyon yağı
·        Mikroskop(100Xobj.)
Metod:
a)Preparat Hazırlanması:
Ø      Temiz bir lam üzerine öze ile bir damla steril fizyolojik tuz çözeltisi damlatılır.
Ø      Öze bunzen alevinde sterilize edilir,soğuması için kısa süre beklenir.
Ø      Steril öze ile katı besiyerinden bir miktar kültür alınır.
Ø      Kültür lam üzerine damlatılmış su ile karıştırılır.
Ø      Öze bunzen alevinde sterilize edilip,yerine konur.
Ø      Preparatın kuruması için bir süre beklenir.
Ø      Bir pens yardımıyla bir ucundan tutulan lam bunzen  aleviden  3 kere geçirilir.
 
b)Boyama Yöntemi:
Ø      Uygulamada hazırlanan preparat üzerine crysal violet damlatılarak 1-2 dak. beklenir.
Ø      Su ile hafifçe yıkanarak boyanın fazlası akıtılır.
Ø      Lugol çözeltisi damlatılarak 1 dak. bekletilir.Sürenin sonunda Lugol çözeltisi akıtılır.
Ø      Preparat %95’lik etil alkol ile yıkanır.(10-15 sn )
Ø      Preparat, saf sudan geçirildikten sonra sulu carbol fuchsin çözeltisi ile 10-30 saniye boyanır.
Ø      Damıtık su ile iyice yıkanır ve kurulama kağıdı ile hafifçe suyu alınır ve kurumaya bırakılır.
Ø      İmmersiyon objektifi ile mikroskopta incelenir.
 
Kullanılan çözeltiler:
Crystal Violet Çözeltisi:
Crystal Violet                0.50 g
Damıtık Su                    100.00 ml
Lugol çözeltisi
İyot                               1.00 g
KI                                 2.00 g
Damıtık Su                   300.00 ml
Carbol Fuchsin (Ziehl-Neelsen)
Basic fuchsin                               1.00 g
Etanol (%95)                               10.00 ml
Fenol (%5’lik çözeltisi suda)      100.00 ml   
 

2.Küf Boyama:
Materyal:
·        Lam
·        Öze
·        Küf kültürü
·        Lactofenol
·        %95’lik etil alkol
·        Kurutma kağıdı
·        İmmersiyon yağı
·        Mikroskop
·        Lamel
Metot:
Ø      Temiz bir lam üzerine bir damla lactofenol çözeltisinden damlatılır.
Ø      İğne uçlu öze ile spor yapısını içeren kültür bir miktar besiyeri ile birlikte alınarak çözelti üzerine konur.
Ø      Üzerlerine bir damla alkol damlatılıp hava kabarcığı kalmayacak şekilde lamel kapatılır.
Ø      Preparat mikroskopta incelenir.
 
Kullanılan Çözeltiler: 
Lactofenol Çözeltisi:
Fenol (kristal)                20 g 
Laktik Asit                     20 g
Gliserol                          40 g
Saf su                             100 ml
 
Hata Kaynakları:
·        Yeterli steril koşullarda çalışmama.
·        Besi yerinden kültür alımına dikkat etmeme.
·        Preparat alınırken kültürün lam üzerindeki su ile iyice karıştırılmaması.
·        Mikroorganizmaların lam üzerine iyice fiksasyon edilmemesi.
·        Damlatılan boyaların gereğinden fazla veya az damlatılması.
·        Bekleme sürelerinin yeterli olmaması.
·        Su ile yıkamada mikroorganizmaların kayıp olması.
·        Kurutma kağıdının fazla bastırılması.
·        Küf boyamada lamelin hava alacak şekilde kapatılması.
 
Ekler:
→Gıdadaki mikroorganizmaların tüm yüzeye yayılması için parçalama işlemi yapılır. Bu işleme homojenizasyon denir. Homojenizasyonda üç tip alet kullanılır:
-Stomacher: Dilüsyon sıvısı  içinde bulunan maddeyi pedalları ile döverek parçalayıp sıvıya homojen olarak dağıtan alettir.
-Blender: İçinde bulunan bıçağın dönmesi sonucu homojenizasyon sağlayan alettir.
-Top drive homogenizer: Bıçağın üstten aşağıya dönerek inmesiyle homojenizasyon sağlayan alettir.
 
Gram pozitif bakterilerin alkol ile muameleden sonra crystal violet-iyot kompleksini bırakmamalarının nedeni hücre duvarının özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Gram-negatif bakterilerde ince bir peptidoglycan tabaka bulunur ve yağ oranı daha fazladır. Gram-pozitif bakterilerde ise peptidoglycan tabaka daha kalındır. Gram boyamanın uygulanmasından sonra oluşan crystal violet-iyot kompleksi, alkol ile yıkamada gram pozitif bakterilerde kalın peptidoglycan tabakadan çıkamaz ve hücre içinde kalarak hücrenin mor renkte görünmesine neden olur. Gram negatif bakterilerde ise alkol, hücre duvarının dışındaki lipopolisakarid tabakada delikler oluşturur. Böylece alkolden sonraki su ile yıkamada boya yıkanır ve gram negatif bakteriler başlangıçtaki şeffaf durumlarına dönerler. Bu aşamadan sonra bakteriler karşıt boya olan safranin ile boyandıklarında boyayı tuttukları için renkleri pembe-kırmızı görünür. Gram pozitif bakterilerde safraninin bir etkisi olmadığı için hücrenin renginde son olarak bir değişiklik  meydana gelmez.